LE
MICORRIZE COME AGENTI DI BIOPROTEZIONE NEI CONFRONTI DEL MAL DELL’INCHIOSTRO
DEL CASTAGNO
BRANZANTI M.B. e GENTILI M.
Dipartimento di Biotecnologie Agrarie e Ambientali, Università degli Studi di Ancona, Via Brecce Bianche, 60131 Ancona , e-mail branzanti@popcsi.unian.it fax 071/2204858
In natura la maggior
parte delle piante possiede micorrize. Le micorrize sono associazioni
simbiontiche tra radici di piante e funghi del terreno che assumono
caratteristiche morfologiche e fisiologiche differenti in relazione alla specie
di pianta e di fungo coinvolti (Smith e Read, 1997). Il castagno come numerose altre Angiosperme, possiede
ectomicorrize che sono caratterizzate: i) dalla presenza di un mantello di ife
fungine che circondano le radici assorbenti; ii) da ife che penetrano nello strato corticale con andamento
intercellulare; iii) da un sistema di elementi ifali che stabiliscono
connessioni essenziali tra le radici della pianta e i corpi fruttiferi dei funghi responsabili della simbiosi. La
presenza, intorno alle radici assorbenti, di una fitta rete di ife fungine in
grado di esplorare volumi maggiori di terreno con minore dispendio energetico,
consente alla pianta-ospite una
maggiore efficienza nell’assorbimento del fosforo e di altri elementi minerali
nei confronti di una pianta non micorrizata e ne favorisce lo sviluppo
soprattutto in terreni a basso contenuto di fosforo. Oltre al ruolo
nutrizionale, le micorrize sono in grado di indurre anche una minore suscettibilità
agli stress di natura biotica e abiotica ( Duchesne 1994). I funghi
micorrizici, infatti, quali componenti della popolazione della rizosfera sono
in grado di svolgere un’azione deterrente nei confronti di patogeni radicali. I
primi rilievi sull’effetto protettivo delle micorrize sulla pianta-ospite nei
confronti di marciume radicale risalgono alla fine degli anni “60”, quando fu osservato che piante di pino naturalmente micorrizate erano resistenti ad
attacchi di marciume radicale causato
da Phytophthora cinnamomi a
differenza di quelle non micorrizate (Zak 1964).
Contributi
sperimentali, anche in anni più recenti, hanno dimostrato una evidente capacità
antagonistica di alcune specie di funghi ectomicorrizici nei confronti di patogeni agenti di marciume radicale di
conifere sia in prove in vitro che in vivo (Marx e Davey 1969; Duchesne et al. 1989; Kope e Fortin 1989;
Chakravarty et al. 1991; Branzanti e
Zambonelli 1994).
Diversi sono i meccanismi coinvolti: i) presenza di uno strato di ife che avvolge
l’apice radicale con funzione di barriera meccanica; ii) competizione per le
sostanze nutritive nella rizosfera e sulla superfice delle radici e quindi per
i siti di infezione; iii) produzione e liberazione da parte dei funghi
ectomicorrizici di sostanze antibiotiche e/o antifungine che modificano gli
essudati radicali della pianta-ospite creando condizioni sfavorevoli alla
germinazione e allo sviluppo del patogeno (Marx 1972;. Duchesne et al.
1988). Osservazioni condotte sulla morfologia ifale di
alcuni patogeni in coltura duale con funghi ectomicorrizici hanno evidenziato
modificazioni quali raccorciamento e ingrossamento delle ife come reazione ai
metaboliti extracellulari prodotti dai
funghi antagonisti (Branzanti et al.
1994).
Anche il castagno trae
benefici dalla simbiosi micorrizica. Una
micorrizazione nelle prime fasi di sviluppo dei semenzali o delle piantine ottenute da micropropagazione ne
favorisce lo sviluppo e la sopravvivenza in vivaio o in serra (Branzanti e
Zambonelli 1986; Branzanti et al.
1999; Martins et al. 1996, Martins et al. 1997). In campo, un apparato
radicale micorrizato consente una
più efficiente esplorazione del suolo da parte delle radici e l’instaurarsi di condizioni più favorevoli alla coltivazione del
castagno: le ife fungine, che avvolgono le radichette assorbenti, inducono
nella pianta una maggiore efficienza sia a livello nutrizionale sia
nell’assorbimento dell’acqua e conseguentemente una maggiore resistenza agli
stress idrici. Inoltre la presenza di micorrize può rendere il castagno
meno suscettibile o resistente a patogeni che attaccano il colletto quali P.
cinnamomi e P.cambivora , agenti del
Mal dell’inchiostro (Branzanti et al.
1999).
Le tecniche
attualmente utilizzate per la produzione di semenzali di castagno non prevedono
una inoculazione micorrizica nella fase di vivaio e i substrati impiegati non
favoriscono la micorrizazione delle piantine, che quando vengono messe a
dimora, sono prive di micorrize. Inoltre, anche se nella maggior parte delle
aree castanicole i funghi ectomicorrizici sono diffusi, l’instaurarsi della
simbiosi richiede tempo e, soprattutto nelle prime fasi, può costituire una
ulteriore costo a livello energetico per la pianta già in situazione di stress
per il trapianto in campo. Per questi motivi una precoce inoculazione con
funghi simbionti (opportunamente selezionati in base alla loro efficienza
micorrizogena e adattabilità alle condizioni di campo) consentirebbe la messa a
dimora di piante dotate di un sistema radicale più efficiente e quindi in grado
di superare meglio lo stress da trapianto.
Alla luce di questi aspetti, in collaborazione tra l’Università di Bologna e quella di Ancona, è stato condotto uno studio relativo all’influenza di funghi micorrizici nei confronti sia del castagno che del Mal dell’inchiostro e alla loro efficacia come biofertilizzanti e bioprotettori. Nel presente lavoro vengono riportati una parte dei risultati ottenuti.
La ricerca è stata articolata in tre fasi successive:
Nella prima fase, si è voluto verificare se alcuni basidiomiceti che, fanno parte della micoflora del castagno, sono in grado di indurre la formazione di micorrize su semenzali in ambiente controllato e incrementare lo sviluppo vegetativo della pianta.
Nella seconda fase è stata saggiata la capacità antagonistica dei funghi ectomicorrizici (precedentemente utilizzati) nei confonti di P.cinnamomi e P. cambivora in prove in vitro.
Nella terza fase dello ricerca si è voluto verificare se una precoce micorrizazione era in grado di proteggere i semenzali di castagno da attacchi di agenti di Mal dell’inchiostro in condizioni di serra.
Sono stati impiegati i seguenti funghi micorrizici: Laccaria laccata, Hebeloma sinapizans, H. crustuliniforme e Paxillus involutus allevati inizialmente su agar patata (PDA Difco) e in seguito su mezzo nutritivo liquido (Modifield Melin Norkrans solution), secondo la metodologia di Marx e Kenney (1982) in tubi di coltura mantenuti in termostato a 24°C. Il micelio così prodotto è stato trasferito, in beute da 2 litri contenenti 1400 ml di vermiculite, 50 ml di torba e 750 di MMN liquido, precedentemente sterilizzati.
E’ stato ottenuto secondo il metodo di Chen e Zentmeyer (1970) leggermente modificato. Si sono utilizzate colture di P. cinnamomi e P. cambivora fatte sviluppare su mezzo agarizzato con aggiunta di V8 (Campbell) per 2 settimane al buio a 24 °C. Il micelio è stato lavato 4 volte a intervalli di un’ora con 15-20 ml di una soluzione salina (nitrato di calcio 1mM, nitrato di potassio 5mM, solfato di magnesio 4mM, ferro chelato in 1 litro di acqua distillata), incubato a 24 °C, raffreddato a 5°C e riportato poi a 24°C. Dopo 8 ore era iniziata la sporulazione. Successivamente il micelio (che aveva prodotto gli sporangi), veniva sottoposto a lavaggio con acqua distillata sterile, raffreddato a 5°C per 15-20 minuti e riportato a 24°C. La liberazione delle zoospore avveniva un’ora dopo. Le piante erano inoculate con 3 ml della sospensione di zoospore alla concentrazione di 80x105 per ml.
La superficie fogliare è stata misurata con un fogliarimetro 7 mesi dopo la semina e 5 mesi dopo l’inoculazione con il patogeno. I pesi secchi delle porzioni epigee e ipogee sono stati determinati dopo averle tenute in stufa alla temperatura di 80°C per 48 ore. La percentuale di micorrizazione è stata determinata prelevando 100 radichette casualmente da 5 piante per ciascuna tesi e contando gli apici micorrizati (Grand e Harvey, 1982).
L’infezione di P. cinnamomi sul castagno è stata valutata in base alla presenza/assenza dei sintomi sull’apparato aereo (clorosi fogliari e riduzione della superficie) e di micelio sugli apici radicali. I dati ottenuti sono stati elaborati statisticamente mediante analisi della varianza, e confrontati con il test di Student-Newmann-Keuls.
Si sono impiegati frutti di Castanea sativa stratificati in torba e sabbia sterili (1:1 v/v) a 5°C per 4 mesi. L’inoculazione con i funghi micorrizici (Laccaria laccata, Hebeloma sinapizans, H. crustuliniforme e Paxillus involutus) è avvenuta al momento del trapianto dei semenzali mescolando l’inoculo di ciascun fungo micorrizico al substrato di coltura in proporzione 1:6 (v:v). Il substrato era costituito da una miscela sterile di torba, sabbia e terreno nelle proporzioni di 6:1:1 (v:v). Dopo 4 mesi in cella climatizzata (20°C, 60% UR, fotoperiodo naturale) i vasi sono stati trasferiti in cella fredda per la durata di 2 mesi e disposti secondo uno schema a randomizzazione completa. Venti semenzali sono stati inoculati con L. laccata, venti con Hebeloma sinapizans, venti con H. crustuliniforme, venti con Paxillus involutus e venti non inoculati.
Dopo sei mesi sono stati eseguiti rilievi sullo sviluppo vegetativo e sulla percentuale di micorrizazione.
E’ stata saggiata in vitro la capacità antagonistica dei funghi ectomicorrizici (precedentemente utilizzati) nei confronti di P.cinnamomi.
Per ciascuna combinazione fungo ectomicorrizico-fungo patogeno sono state predisposte colture duali in capsule Petri contenenti agar-patata (PDA) secondo il metodo descritto da Marx (1969) modificato. Dischetti di 6 mm di diametro sono stati prelevati da colture di tre settimane dei funghi ectomicorrizici e posti alla distanza di un centimetro dal bordo di una capsula Petri. Dopo due settimane di incubazione le piastre sono state inoculate con dischetti di 6 mm di diametro di P.cinnamomi e P. cambivora, collocati alla distanza di 2 cm dal margine del micelio del simbionte sulla stessa linea diametrale. Dopo 2 settimane di coltura è stata osservata l’interazione tra i due miceli e valutata la capacità dei funghi simbionti di inibire la crescita miceliare dei due patogeni secondo Bonfante et al. (1972).
Sei mesi dopo il trapianto, i semenzali di castagno, sia quelli micorrizati che quelli non micorrizati, sono stati inoculati con P. cinnamomi. Cinque mesi dopo l’inoculazione del patogeno, di ciascuna tesi sono state raccolte cinque piante e di queste determinati la superficie fogliare e i pesi secchi dell’apparato epigeo e ipogeo. Le tesi erano le seguenti:
1) Piante testimoni
2) Piante inoculate con P. cinnamomi
3) Piante micorrizate con L. laccata e inoculate con P. cinnamomi
4) Piante micorrizate con P. involutus e inoculate con P. cinnamomi
5) Piante micorrizate con H. crustuliniforme e inoculate con P. cinnamomi
6) Piante micorrizate con H. sinapizans e inoculate con P. cinnamomi
Sei mesi dopo il trapianto, gli apparati radicali di tutte le piante inoculate risultavano ben micorrizati con percentuali comprese tra 40 e 57%. Le micorrize avevano l’aspetto tipico di quelle riscontrate nelle latifoglie: inizialmente semplici e allungate (mai dicotomiche), si sviluppavano poi in forme monopodiali–pinnate a seconda della specie fungina, circondate da un mantello ifale di spessore diverso. Le micorrize di H. sinapizans erano caratterizzate da apici allungati, completamente circondati da micelio fioccoso, di colore biancastro costituito da un strato di ife compatto nella parte interna, più lasso nella parte esterna (Figg.1 e 2).
La colonizzazione delle radici da parte dei funghi ectomicorrizici ha determinato sui semenzali un effetto crescita: le piante inoculate presentavano un maggiore sviluppo sia della parte epigea che di quella ipogea e incrementi nei valori della biomassa. Questi, nelle piante micorrizate, erano superiori a quelli delle piante testimoni con differenze statisticamente significative (Fig. 3), tranne che nei castagni colonizzati da H. crustuliniforme.
I risultati dell’esperimento 1 evidenziano che una inoculazione precoce può favorire e stimolare la crescita dei semenzali di castagno anche in condizioni di serra, seppure con modalità diverse in funzione della specie fungina. La micorrizazione induce un aumento della superficie assorbente del sistema radicale, grazie allo strato di ife che circondano gli apici radicali e che si sviluppano nel terreno e, contemporaneamente, rende la pianta potenzialmente più efficiente nei confronti dell’assorbimento minerale.
I funghi micorrizici hanno determinato una inibizione dello sviluppo del micelio dei patogeni saggiati seppure in modo differenziato. (Branzanti et al. 1994). Il fungo micorrizico può o invadere il micelio dello stesso patogeno sovrapponendosi ad esso, come osservato per Paxillus involutus (Fig.4) o inibire la crescita del patogeno senza venirne a contatto come per H. sinapizans (Fig. 5). In questa combinazione la colonia del patogeno appare a forma di ventaglio allargato dalla parte opposta rispetto al fungo micorrizico.
I risultati dell’esperimento 2 sembrano indicare che la capacità antagonistica del fungo micorrizico, in condizioni di laboratorio, sia dovuta alla produzione di sostanze ad azione fungistatica in grado anche di indurre modificazioni sulla morfologia delle ife del patogeno che appaiono notevolmente accorciate e ingrossate in corrispondenza della zona di inibizione.
P. cinnamomi riduceva lo sviluppo dei semenzali del castagno non micorrizati. Cinque mesi dopo l’inoculazione con il patogeno, le piante erano meno sviluppate rispetto a quelle non infettate: avevano foglie più piccole (con una riduzione della superficie fogliare del 40%) e con ampie aree clorotiche. L’effetto negativo del patogeno era ben evidente anche a livello del sistema radicale che risultava ridotto di circa il 48%. I pesi secchi delle porzioni ipogee ed epigee erano inferiori a quelli delle piante non inoculate con il patogeno con differenze statisticamente significative (Fig.6).
Al contrario, i semenzali precedentemente colonizzati dai funghi micorrizici e successivamente inoculati con il patogeno, non mostravano alcun sintomo della malattia (apparato fogliare normalmente sviluppato e assenza di aree clorotiche). Anche a livello di biomassa, non risultavano modificazioni o riduzioni dei valori (Fig. 6).
Per quanto riguarda la presenza del patogeno e/o dell’infezione nei semenzali, questa è stata osservata solo nelle piante non micorrizate. In queste, le ife di P. cinnamomi avvolgevano completamente le radichette provocando la lisi delle pareti delle cellule corticali e distruggendole (fig. 7). Nelle radici delle piante infettate dal patogeno erano presenti anche numerose oospore.
Nelle piante micorrizate, invece, non è stata osservata la penetrazione del patogeno. Questo o risultava completamente assente (Fig. 8) oppure era presente sotto forma di qualche zoospora non germinante sullo strato di ife del fungo micorrizico intorno alle radichette.
I risultati qui riportati mostrano che la simbiosi micorrizica è in grado di ridurre o eliminare gli effetti negativi provocati da di P. cinnamomi su castagno. Semenzali di C. sativa precedentemente micorrizati non sono suscettibili al Mal dell’inchiostro. Lo strato miceliare più o meno compatto che avvolge gli apici radicali micorrizati agisce come barriera meccanica impedendo la penetrazione del patogeno. Ife di P. cinnamomi sono presenti solo nei segmenti di radice non micorrizati dove manca lo strato ifale. L’assenza di micorrizazione nelle radici consente invece al patogeno di penetrare, di svilupparsi e danneggiare le cellule epidermiche.
L’effetto meccanico del mantello ifale è solo uno dei numerosi meccanismi coinvolti nella protezione di piante micorrizate nei confronti di microrganismi fitopatogeni quali barriera di tipo chimico, produzione di sostanze antibiotiche e antifungine o competizione che, agendo in maniera sinergica, non consentono al patogeno di iniziare il processo di infezione inibendo la germinazione delle spore e/o lo sviluppo del patogeno (Marx 1973). Studi condotti parallelemente hanno evidenziato che spore di P. cinnamomi, in presenza di radici di castagno micorrizate, germinano in percentuali basse come se i funghi ectomicorrizici fossero in grado d’inibire la formazione del tubetto germinativo (risultati non pubblicati).
In conclusione, i risultati qui esposti dimostrano che la colonizzazione da parte di funghi ectomicorrizici impedisce o riduce l’infezione di P. cinnamomi nelle radici di semenzali di castagno. L’effetto protettivo sembra essere quindi in relazione alla formazione di micorrize e successivamente alla mancanza di penetrazione del patogeno. In accordo a quanto riportato da Duchesne (1994), è necessario che la simbiosi micorrizica si instauri prima che avvenga il processo di infezione da parte del patogeno, anche se i funghi micorrizici qui sperimentati sono in grado di esercitare un’azione deterrente nei confronti di altri patogeni del terreno prima della formazione delle micorrize (Branzanti e Zambonelli 1994; Zambonelli et al. 1995).
Le micorrize sono estremamente vantaggiose per il castagno in quanto possono agire sia a livello nutrizionale sia come deterrenti nei confronti di agenti di Mal dell’inchiostro.
La produzione di semenzali inoculati con funghi ectomicorrizici può essere estremamente vantaggiosa nell’impianto di nuovi castagneti in quanto la presenza di radici micorrizate crea condizioni più favorevoli alla coltivazione del castagno migliorando la qualità del terreno (arricchimento di sostanza organica e maggiore efficienza per quanto riguarda il drenaggio). D’altra parte gli agenti del Mal dell’inchiostro spesso prediligono terreni scarsamente drenati e poveri; le micorrize, invece, sono in grado di determinare condizioni sfavorevoli allo sviluppo del patogeno (Bonous e Abreu Gomes 1998, Abreu et al. 1993).
In una agricoltura a basso impatto ambientale che prevede una limitazione dell’impiego sia dei fertilizzanti chimici che dei fungicidi e una ottimizzazione degli interventi, l’utilizzazione dei funghi micorrizici può rappresentare una valida alternativa in quanto consente di ottenere condizioni favorevoli alla coltivazione del castagno e contemporaneamente al contenimento del Mal dell’inchiostro.
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Si ringrazia il Prof. G. Cristinzio del Dipartimento di Arboricoltura,
Botanica e Patologia Vegetale dell’Università di Napoli “Federico II” (Portici)
per aver fornito gli isolati di Phytophthora. cinnamomi e P. cambivora.
Tab.1 - Effetto della micorrizazione sullo
sviluppo vegetativo di semenzali di castagno sei mesi dopo l’inoculazione.(per
ciascuna colonna lettere diverse indicano differenze statisticamente
significative per P=0,05).
|
Trattamento |
Area fogliare (cm2) |
Peso secco radici (g) |
Peso secco fusto (g) |
|
|
|||
Testimone
|
12,3 a |
3,71 a |
3,64 a |
|
Laccaria laccata |
30,2 b |
6,83 c |
5,51 b |
Paxillus involutus
|
22,1 ab |
5,01 b |
4,47 ab |
|
H. crustuliniforme |
24,2 ab |
4,66 a |
3,86 a |
|
H. sinapizans |
28,7 b |
5,88 bc |
4,71b |
Tab.2 -Effetto di P. cinnamomi su semenzali di C.
sativa micorrizati e non micorrizati cinque mesi dopo l’inoculazione con il
patogeno (lettere diverse indicano differenze statisticamente significative per
P=0,05).
|
Trattamento |
Area fogliare (cm2) |
Peso secco radici (g) |
Peso secco fusto (g) |
|
|
|||
|
Testimone |
21,3 b |
4,7 bc |
4,63 c |
|
Laccaria laccata + C. cinnamomi |
27,79 c |
5,13 c |
4,20 c |
Paxillus involutus +
C.
cinnamomi
|
18,79 ab |
3,21 b |
3 b |
|
H. crustuliniforme + C. cinnamomi |
22,03 b |
3,08 b |
2,65 ab |
|
H. sinapizans+ C. cinnamomi |
27,70 c |
5,47 c |
4,56 c |
|
P.
cinnamomi |
12,06 a |
2,45 a |
2,5 a |