Servizio di
elettroforesi capillare:
Aggiornato il 07/01/2009
I campioni da sottoporre ad elettroforesi capillare dovranno essere conferiti al servizio risospesi in 10 uL di formamide Hi-Di (che il gruppo sequencing si impegna a fornire agli utenti che ne facciano richiesta) e denaturati. Per denaturare sono sufficienti 5 minuti a 96°C seguiti da un rapido abbassamento della temperatura a 4°C.
Le reazioni di sequenza devono essere purificate mediante precipitazione con Etanolo/EDTA; Etanolo/NaAc, colonnine da vuoto, colonnine per centrifuga (potete richiedere protocolli e suggerimenti presso la piattaforma), eluendoli in appositi buffer o risospendendo in fomamide. È possibile richiedere la purificazione dei campioni mediante il kit big dye Xterminator segnalandolo chiaramente sul modulo di richiesta; in tal caso dovranno essere consegnati 10 ul di amplificato BigDye per ciascun campione.
In caso di analisi AFLP e simili, non è necessario procedere alla purificazione dell’amplificato ma è fortemente raccomandato non eccedere con le quantità di primer marcato in fase di amplificazione selettiva. In caso di SNaPShot è consigliabile procedere ad una degradazione enzimatica dei nucleotidi non incorporati (SAP o CIP; vedere protocollo Applied Biosystem). Aggiungere 1 ul di amplificato precedentemente diluito (almeno 1:5 per gli AFLP, 1:2 per lo SNaPShot) a 9 ul di una mix composta per il 98% circa di formamide HiDi e per il 2% circa di marcatore di peso molecolare (500 Rox, 600 Liz o altro). Per stabilire la diluizione necessaria per una ottimale lettura dei vostri campioni è consigliato fare delle prove preliminari con diluizioni progressive.
È stato elaborato e diffuso un nuovo modulo per la richiesta di elettroforesi capillare (sequenze, AFLP, etc.). Il modulo è in formato Excel ed è studiato per facilitare la compilazione da parte dell'utente, ma anche per organizzare i dati in maniera da ridurre al minimo gli errori di trascrizione in fase di allestimento della piastra.
Vi preghiamo di cestinare i vecchi moduli e di utilizzare soltanto questo, da ora in poi.
Il modulo va compilato e riconsegnato in formato elettronico (via e-mail all’indirizzo genopom@unina.it, o su un supporto USB). Una stampa del modulo compilato va consegnata insieme ai campioni. E’ importante che sul modulo, oltre al codice identificativo di ciascun campione, siano indicati:
-la data, il richiedente, il gruppo di afferenza, l’indirizzo e-mail e l’interno del richiedente
- tipo di analisi (sequenziamento o analisi di frammenti)
- eventuale richiesta di purificazione con kit XTerminator
- chimica utilizzata (BigDye v.1.1 - BigDye v.3.1)
- la spettrale desiderata (solo nel caso di analisi di frammenti)
I campioni da processare vanno lasciati nel frigo del laboratorio centrale. Assieme ad essi e’ necessario lasciare il modulo di richiesta elettroforesi capillare già compilato, nel raccoglitore apposito, sistemato di fianco al frigo. Ora è disponibile un nuovo punto di ricezione dei campioni da analizzare direttamente presso il laboratorio della Piattaforma Tecnologica nella Palazzina n.75 Genopom (ex-Estimo).
Una copia del modulo di richiesta va sempre inviata all’indirizzo genopom@unina.it.
E' preferibile consegnare i campioni in piastre da 96 (indicando il nome dei campioni in corrispondenza delle coordinate di ciascun pozzetto indicate nel modulo). In alternativa consegnate i campioni in strip da 8 o in eppendorf da 0.2 ul numerate con i codici indicati nel modulo (da A01 ad H12). In caso di più strip, assegnate un codice numerico da 01 a 12 a ciascuna strip; i campioni in ciascuna strip corrispondono, dal primo all’ottavo, alle otto lettere da A ad H. Non è necessario riportare i nomi dei campioni sulle eppendorf: li leggeremo dal modulo! Vi preghiamo di evitare di consegnare campioni in eppendorf più grandi.
IMPORTANTE: consegnate le vostre piastre, strip, o eppendorf in scatoline porta puntali o altro contenitore su cui sia indicata in maniera chiara il nome del gruppo! In caso consegniate più di una piastra di campioni nello stesso giorno utilizzate più moduli appositamente nominati ed indicate un codice su ciascuna piastra che permetta di collegare in maniera corretta le piastre alle informazioni contenute nel modulo.
Non consegnate campioni non denaturati o non risospesi: la diversificazione del tipo di lavorazione necessaria per ciascun campione fa aumentare le probabilità che vengano commessi errori!
I file delle sequenze analizzate (nel formato .ab1) saranno inviati per e-mail all’indirizzo indicato nel modulo di richiesta d’analisi. In caso di analisi di frammenti i file saranno in formato .fsa e saranno corredati da una tabella di lettura preliminare in formato Excel. Per l’interpretazione di questi ultimi dati e per ogni evenienza restiamo comunque a disposizione.
Angelina Nunziata Luigi De Masi Gaudenzio Delle Donne
Analisi di frammenti Real time Sequenziamento