Piante transgeniche resistenti a malattie fungine (Rhizoctonia solani) ottenute tramite trasformazione gentica con un gene di fungo antagonista.
Caratterizzazione molecolare di Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli. La caratterizzazione di F. oxysporum f. sp. phaseoli, un importante patogeno del fagiolo, è stata effettuata per la prima volta determinando le razze fisiologiche (patotipi), i gruppi di compatibilità vegetativa (VCGs), i profili di restrizione (RFLPs) e i prodotti dell’amplificazione a caso del DNA genomico (RAPDs). L’integrazione dei dati ottenuti ha mostrato una notevole variabilità genetica in questa forma specialis di Fusarium, una correlazione genetica tra VCGs e patotipi e una stretta relazione tra profili di restrizione/amplificazione e origine geografica degli isolati. Questi risultati hanno dimostrato l’utilità delle tecniche di analisi del DNA applicate per individuare la provenienza geografica di ceppi patogeni di F. oxysporum f. sp. phaseoli, e la loro correlazione tassonomica. Sono state inoltre individuate caratteristiche genetiche che possono essere potenzialmente utilizzate a scopi diagnostici, e cioè sequenze genomiche che potrebbero differenziare ceppi non-patogeni da quelli patogeni. Un’analisi molecolare del genoma di isolati di F. oxysporum f. sp. phaseoli e di altri Fusaria ha mostrato la presenza di elementi di dsRNA, che sono stati visualizzati sotto forma di bande elettroforetiche, e poi isolati e clonati in plasmidi/cosmidi. I profili ottenuti sono complessi ed è stata individuata una relazione tra la presenza di dsRNA e quella di virus-like particles (VLPs) evidenziate al TEM, indicando che il dsRNA scoperto per la prima volta in F. oxysporum potrebbe essere di origine virale. Non è stata ancora invece trovata una relazione tra la presenza di dsRNA e patogenicità o virulenza degli isolati. Alcuni dei risultati sono stati raccolti nel volume “Molecular Variability of Fungal Pathogens” con un capitolo sul Fusarium oxysporum (publicazioni).
Cariotipizzazione e studio dei meccanismi di ricombinazione genetica di funghi antagonisti del genere Trichoderma. Sono state utilizzate le tecniche RFLPs, RAPDs ed elettroforesi in campo pulsato (TAFE) allo scopo di sviluppare un metodo di cariotipizzazione elettroforetica per funghi filamentosi, ottenendo la completa separazione dei cromosomi di Trichoderma harzianum. Queste e altre tecniche molecolari sono state utilizzate anche per studiare il meccanismo di ricombinazione asessuale che segue l’anastomosi ifale. E’ stato scoperto che in T. harzianum la ricombinazione non corrisponde al tipico ciclo parasessuale, poichè il genoma della progenie proviene interamente da un unico ceppo parentale in cui vengono integrate solo determinate sequenze genetiche dell’altro genitore, a seconda anche delle condizioni ambientali. Questo particolare meccanismo di ricombinazione, recentemente individuato anche in altri funghi filamentosi, è stato definito “interstrain gene transfer” e potrebbe rappresentare un importante meccanismo alla base della plasticità genetica tipica di molti funghi patogeni e antagonisti (publicazioni).
L’attività di ricerca mirata allo studio di meccanismi antagonisti è stata
rivolta principalmente verso funghi dei generi Trichoderma e Gliocladium, i
funghi antagonisti più studiati ed applicati in lotta biologica, e ha permesso
di chiarire aspetti fondamentali delle interazioni antagonista-patogeno che si
realizzano nel suolo e sulla pianta. Questa attività si è inserita in un programma
di ricerca ad ampio raggio, condotto utilizzando metodi spesso innovativi di tipo
biochimico, biologico e genetico-molecolare. I risultati ottenuti e le conoscenze
acquisite hanno permesso di individuare diverse strategie fitosanitarie e nuove
biotecnologie fitopatologiche (ad es. selezione di nuovi biopesticidi, produzione
di varietà transgeniche resistenti alle malattie, uso di enzimi ad elevata attività
antifungina, ecc) (publicazioni,
brevetti)
Ruolo degli enzimi degradativi
della parete cellulare fungina nei meccanismi di biocontrollo.
Questa attività di ricerca, iniziata durante la permanenza alla Cornell University
nel periodo 1991-1993 e continuata attivamente dopo il rientro in Italia a partire
dal 1994, rappresenta uno dei maggiori filoni di ricerca. Il programma seguito
ha coperto una varietà di aspetti, incluso la purificazione e caratterizzazione
degli enzimi, il clonaggio dei relativi geni, la distruzione delle sequenze codificanti
per provarne il ruolo nel biocontrollo, l’analisi dei relativi promotori con metodi
innovativi, l’uso di sistemi reporter (GFP e glucosio-ossidasi) per chiarire i
meccanismi di induzione del biocontrollo, e la trasformazione dei geni di Trichoderma
in pianta. I risultati di questa attività possono essere riassunti così:
·
Gli enzimi degradativi
della parete cellulare fungina (chitinasi e glucanasi) prodotti dal Trichoderma
sono stati purificati e caratterizzati, ed è stato scoperto che essi sono dotati
di una forte attività antifungina da ampio spettro.
·
Sono state identificate
combinazioni sinergiche tra diversi enzimi dotati di attività complementari
nella degradazione della parete cellulare fungina.
·
E stata scoperta una
forte interazione sinergica tra questi enzimi e il batterio di biocontrollo Enterobacter
cloacae
·
E stata scoperta una
forte interazione sinergica tra chitinasi e glucanasi di Trichoderma
e fungicidi di uso comune quali alcuni triazolici, benomyl e captano. Ciò ha permesso
di avviare un importante programma finanziato dalla Comunità Europea (programmi
di ricerca) e di sviluppare formulazioni miste enzimi-fungicidi da utilizzare
in alternativa al bromuro di metile su alcune colture ortive. In aggiunta è stato
scoperto che gli enzimi di Trichoderma
aumentano notevolmente l’attività del miconazolo nel controllo di micosi animali
e umane (publicazioni,
brevetti).
·
E’ stata scoperta una
forte interazione sinergica tra questi enzimi e diversi antibiotici prodotti dal
Trichoderma durante il biocontrollo.
·
E’ stata messa a punto
una nuova tecnica di trasformazione per Trichoderma, Gliocladium,
Sepedonium, Fusarium e per altri generi di funghi filamentosi utilizzando il bombardamento
biolistico (gene gun). Questa tecnica oggi comunemente usata in molti laboratori
permette di evitare la produzione di protoplasti e di ottenere elevati livelli
di trasformazione nucleare. E’ stato inoltre scoperto un sistema di silenziamento
dell’espressione di sequenze geniche trasformate che si basa su un meccanismo
di metilazione-demetilazione delle stesse.
·
Sono stati clonati
e caratterizzati i geni che codificano per le chitinasi e glucanasi dotate dell’effetto
antifungino più marcato (ThEn-42 e ech42 (endochitinasi),
nag1 (esochitinasi), gluc78
(ß-1,3-glucanasi)), e altre sequenze di Trichoderma
espresse ad alti livelli durante l’antagonismo:
pyrdeh1 (piruvato deidrogenasi), CitTh
(citocromo reduttasi) ecc. Tra queste ultime, è stato anche clonato, sequenziato
e caratterizzato il gene codificante per una proteina 14.3.3, appartenente ad
una famiglia di proteine coinvolte in una gran varietà di funzioni biologiche,
ma i cui geni non erano stati ancora scoperti nei funghi filamentosi.
Alcuni di questi geni sono stati trasferiti in altri organismi antagonisti,
tra cui lieviti utilizzati per proteggere derrate alimentari durante la frigoconservazione,
per migliorare il biocontrollo
·
E’ stato dimostrato
per la prima volta nel biocontrollo il ruolo di un enzima fungino distruggendo
in maniera mirata e selettiva il relativo gene. Una approfondita caratterizzazione
biochimica, genetica e fisiologica dei mutanti difettivi ottenuti ha mostrato
tra l’altro una forte riduzione delle capacità di antagonismo e quindi ha permesso
di identificare il primo gene fungino necessario per il biocontrollo.
·
Sono stati clonati
i promotori dei geni più importanti (ech42 e nag1), ne è stata
dimostrata e studiata nei dettagli l’attivazione durante il biocontrollo (essi
rappresentano i primi promotori fungini di biocontrollo) ed è stato identificato
un importante fattore di regolazione e il suo sito di legame al DNA. Questo lavoro
è stato pubblicato sulla rivista internazionale Proceedings of the National
Academy of Sciences of USA per il suo interesse multidisciplinare.
·
Sono stati utilizzati,
in collaborazione con ricercatori presso l’Università di Vienna, nuovi sistemi
reporter unendo i promotori di biocontrollo con il gene codificante per la “green
fluorescent protein” (GFP) o la glucosio-ossidasi (GOX). Sono stati ottenuti mutanti
di Trichoderma che diventano fluorescenti
o producono GOX in risposta alla presenza dell’ospite, a fattori di stress o durante
la colonizzazione delle radici o delle foglie. Questo nuovo metodo ha dimostrato
che componenti di parete dell’ospite agiscono da induttori-elicitori del biocontrollo
in Trichoderma, e che vi è una specifica
interazione tra l’antagonista e i vari ospiti fitopagoneni; esso ha inoltre permesso
di studiare in maniera più approfondita la permanenza dell’inoculo dell’antagonista,
e la colonizzazione del terreno, dell’ospite o di altri substrati naturali. Infine
questa ricerca ha permesso di isolare per la prima volta le molecole che attivano
e modulano il biocontrollo in Trichoderma,
creando nuove possibiltà applicative, alternative alla modificazione genetica,
per controllare e migliorare l’attività di questi antagonisti
·
E’stato dimostarta un’interazione sinergica tra enzimi degradativi della
parete cellulare fungina eantibiotici (lipodepsipeptidi) prodotti da Pseudomonas
syringae. Questa interazione molecolare sembra essere alla base sia del
meccanismo di biocontrollo di P. syringae, sia di interazioni sinergiche
antifungine che si realizzano tra P. syringae e funghi antagonisti del
genere Trichoderma.
Ruolo di antibiotici e metaboliti
secondari prodotti da Trichoderma spp.
nei meccanismi di biocontrollo. Questa attività di ricerca si integra con quanto descritto nel paragrafo
precedente e ha dimostrato che l’attività di biocontrollo nei confronti di alcuni
patogeni si esplica utilizzando una combinazione di antibiotici ed enzimi degradativi.
Diversi metaboliti sono stati purificati, e il meccanismo di questa interazione
è stato studiato a livello molecolare. Questa attività può essere brevemente descritta
così:
·
E’ stata identificata
l’interazione sinergica tra gliotossina prodotta da T.
virens e chitinasi e glucanasi ottenute dallo stesso ceppo
·
E’ stato dimostrato
che la produzione di trichorzianine A e B e di chitinasi e glucanasi è indotta
contemporaneamente durante il biocontrollo, e che questi potenti antibiotici sono
sinergici nell’attività antifungina con gli enzimi degradativi
·
E’ stato scoperto che
il sinergismo tra enzimi degradativi della parete fungina e composti antibiotici
che alterano le membrane cellulari si può estendere a un gran numero di sistemi
biologici importanti in Patologia vegetale, e riguarda sia le interazioni tra
microorganismi, sia quelle tra pianta e altri organismi
·
Il meccanismo di interazione
antifungino tra tossine ed enzimi degradativi è stato chiarito, dimostrando che
l’effetto sinergico si ottiene perchè l’enzima aiuta la penetrazione della tossina
e la tossina inibisce l’attività delle glucano- e chitina-sintasi localizzate
sulle membrane, impedendo la formazione di nuovi componenti di parete
·
La produzione di trichorzianine
A di T. harzianum durante il biocontrollo
è stata analizzata a livello chimico e biologico, dimostrando la presenza di una
notevole eterogeneità (dovuta alla sintesi di diverse forme della stessa tossina)
e di sostanziali differenze nel livello di attività biologica dei vari componenti.
Studio
del ruolo ruolo degli inibitori di proteasi nei meccanismi patogenetici. Questa attività di ricerca ha riguardato lo studio del ruolo degli inibitori
di proteasi nei meccanismi patogenetici. Per la prima volta è stato dimostrato
che una miscela di inibitori di proteasi da pianta (Brassicacea) è capace di ridurre
la germinazione delle spore e la crescita ifale di funghi patogeni quali Botrytis
cinerea e Fusariun solani f.sp. pisi,
mentre funghi patogeni che specificamente attaccano il cavolo (Alternaria
brassicicola) non sono sensibili a questi
inibitori. Questo lavoro ha indicato
che inibitori di proteasi sono coinvolti nella difesa della pianta non solo contro
gli insetti ma anche contro funghi patogeni. Questa scoperta, evidenziata sulla
copertina della rivista Molecular-Plant Microbe Interactions, è stata anche recentemente
inserita nel libro di testo di Patologia vegetale G. Agrios, Plant Pathology
(publicazioni). Il meccanismo antifungino
è stato recentemente studiato e si è evidenziato che esso si basa probabilmente
sull’inibizione della formazione di componenti strutturali della parete fungina,
quali chitina e glucani. Questo lavoro, recentemente finanziato dall CEE (Marie
Curie programme), sta proseguendo con l’ottenimento di piante transgeniche che
esprimono geni di inibitori di proteasi dotati di attività antimicrobica.
Studio
dell’epidemiologia e della patogenesi di Xanthomonas
campestris pv.
vitians agente di un marciume batterico
della lattuga. Riguarda
uno studio epidemiologico del marciume causato da Xanthomonas campestris pv.
vitians sulla lattuga. Lo studio ha
dimostrato che la malattia si verifica a seguito di bagnatura persistente e prolungata,
e che lo sviluppo epifitico del patogeno più produrre un notevole potenziale d’inoculo.
La suscettibilità delle piante è apparsa correlata allo sviluppo vegetativo, mentre
le erbe infestanti possono avere un ruolo nell’insorgenza della malattia. Sono
stati sperimentati diversi tipi di trattamenti preventivi di lotta chimica, anche
per la disinfezione di partite commerciali di semi, che sono apparse spesso contaminate.
In un altro studio, sono stati isolati e identificati due metaboliti fitotossici
dai filtrati di Xanthomonas campestris
pv. vitians e sono stati determinati gli effetti di questi due derivati
dell’acido metiltiopropanoico su tessuti di foglie e su protoplasti di lattuga
e cavolo. I risultati hanno dimostrato che foglie e protoplasti di lattuga, ma
non di cavolo, sono sensibili a questi composti (che inducono necrosi e clorosi),
dimostrando una specificità di azione di questi metaboliti batterici verso piante
ospiti.
Studi dell’interazione tra
diverse proteine correlate alla patogenesi (PR-proteins).
Sono stati saggiati per l’attività antifungina su B.
cinerea e F. oxysporum una chitinasi
e una osmotina prodotte da tabacco in risposta a infezione o ferita. L’analisi
biologica ha dimostrato che le due PR-proteins interagiscono sinergicamente contro
i patogeni, dimostrando un’elevata attività antifungina solo quando utilizzate
in combinazione. Questo risultato dimostra che il sinergismo tra PR proteins non
si limita solo agli enzimi, come precedentemente chiarito, e suggerisce nuove
strategie molecolari per il miglioramento della difesa biochimica della pianta
contro funghi patogeni.
Studio sui ruoli di permeasi di mebrana nella patogenesi e resistenza a fungicidi.
Studi miranti a definire il ruolo delle permeasi di membrana note come trasportatori
ABC nella polichemioresistenza e nella patogenesi dei funghi filamentosi
e nei meccanismi di antagonismo fungino.
Studi di diagnostica fitopatologica
con metodi molecolari. Sperimentazione di un metodo per facilitare il riconoscimento di funghi
fitopatogeni mediante l’uso di tecniche immunologiche. A questo scopo, è stata
applicata la tecnica della tollerizzazione per ottenere antisieri altamente
specifici per una forma speciale di F.
oxysporum. Gli anticorpi ottenuti reagiscono solo con la forma speciale
usata per l'immunizzazione e non con quella della tollerizzazione, permettendone
così la differenziazione. E’ stat anche prodotta una review di diagnostica fitoapatologica
con metodi molecolari.
Purificazione e caratterizzazione
di tossine prodotte da Verticillium
dahliae.
Sono stati isolati e caratterizzati nuovi metaboliti fitotossici prodotti da Verticillium
dahliae, e ne è stata saggiata
l'attività sia su tessuti vegetali, sia su cellule e protoplasti di genotipi resistenti
e suscettibili di Solanum. I metaboliti identificati, di cui alcuni di natura
proteica, hanno mostrato una maggiore fitotossicità sul materiale proveniente
dai genotipi suscettibili rispetto a quello dei genotipi resistenti, indicando
un loro possibile coinvolgimento nella determinazione dei sintomi della malattia.
Inoltre, la fitotossicità esibita sui protoplasti suggerisce un'azione diretta
dei metaboliti fungini sulle membrane cellulari.
Studio sul ruolo della cerato-ulmina
nella grafiosi dell’olmo.
Uno studio sul ruolo della cerato-ulmina nella patogenesi della grafiosi dell’olmo,
causata dai miceti Ophiostoma ulmi e Ophiostoma
novo-ulmi. Questa indagine ha utilizzato un approccio basato sulla trasformazione
genetica di O. quercus, una specie non
patogena per l’olmo e che non produce cerato-ulmina in coltura, con il gene cu
codificante per la cerato-ulmina in O. novo-ulmi.
L’espressione di questo gene ha conferito ai mutanti di O. quercus la capacità di produrre la fitotossina in
vitro e di causare i sintomi della grafiosi in seguito a inoculazione su piante
di olmo.
Produzione
di nuove varietà di piante ortive resistenti a malattie fungine, utilizzando geni
di funghi antagonisti. Un
risultato particolarmente innovativo è stato ottenuto esprimendo in piante di
tabacco, patata, pomodoro e petunia alcuni geni codificanti per chitinasi che
funghi del genere Trichoderma utilizzano
durante il biocontrollo. I geni fungini sono stati trasferiti in forma genomica,
di cDNA o chimerica (sequenze codificanti di fungo fuse con sequenze regolatrici
di pianta), e l’espressione è stata ottenuta ad alti livelli e studiata in dettaglio.
Tra l’altro è stata dimostrata per la prima volta la possibilità di utilizzare
in pianta sequenze fungine codificanti peptidi segnale per la secrezione extracellulare
di proteine. I saggi di resistenza a malattie sono stati eseguiti sulla progenie
con patogeni di notevole importanza economica appartenenti ai generi Alternaria,
Rhizoctonia, Botrytis, e sono state ottenute linee transgeniche altamente resistenti
a tutti i patogeni saggiati. Il meccanismo di resistenza è stato studiato e si
sono ottenute indicazioni che le proteine di origine fungina oltre ad agire direttamente
sul patogeno stimolano il sistema di difesa della pianta, e comunque non interferiscono
nell’interazione della pianta con altri microorganismi benefici e simbionti (ad
es. non alterano la formazione di micorrize). Con questo lavoro, è stato dimostrato
per la prima volta che è possibile proteggere efficacemente piante coltivate utilizzando
il genoma di funghi antagonisti come sorgente di geni di “resistenza”, ed è stato
avviato l’uso di questi geni in numerosi altri laboratori. Questi risultati, pubblicati
anch’essi su Proceedings of the National Academy of Science of USA hanno
avuto una certa risonanza anche internazionale poiché è relativamente limitato
il numero di geni oggi disponibili che si sono dimostrati sufficientemente attivi
in piante transgeniche contro diverse specie di funghi fitopatogeni. Questa pubblicazione
è stata oggetto di articoli su riviste divulgative, come ad es. il “New Scientist”
(11 luglio, 1998), e ha indotto numerosi gruppi di ricerca a collaborare con il
dott. Lorito e a seguire lo stesso approccio metodologico, utilizzando il genoma
di funghi antagonisti per aumentare la resistenza a fitopatie causate da funghi.
Simili risultati positivi sono stati ottenuti recentemente anche in altri
laboratori, come ad esempio petunie resistenti a Rhizoctonia
solani, meli resistenti alla Venturia
inequalis, vite resistente all’Uncinula
necator, e brassica resistente alla
Rhizoctonia solani. (publicazioni,
brevetti).
Piante transgeniche resistenti a malattie fungine (Rhizoctonia solani) ottenute
tramite trasformazione gentica con un gene di fungo antagonista.
Studio della microflora
batterica di suoli alcalini per ottenere enzimi utili alla lotta sia contro funghi
che insetti patogeni. Questa
ricerca è stata effettuata allo scopo di individuare ceppi batterici capaci di
produrre enzimi che degradano la chitina contenuta nelle pareti cellulari di funghi
e nel tubo digerente (membrana peritrofica) di insetti fitopatogeni, dove si trovano
condizioni di elevati valori di pH. Lo screening effettuato su oltre 100 ceppi
di microorganismi ha permesso di selezionare un ceppo di Streptomyces albidoflavus
che produce chitinasi capaci di inibire attivamente la crescita sia di B.
cinerea e F. oxysporum e sia delle larve di Tricoplusia ni. La caratterizzazione
del sistema chitinolitico di questo batterio ha dimostrato che i geni di S.
albidoflavus, recentemente usati con successo da altri ricercatori per proteggere
piante transgeniche dall’attacco di alcuni insetti, sono utili per il controllo
sia di patogeni fungini che di insetti. Inoltre, è stato dimostrato per la prima
volta che batteri del genere Streptomyces
rivestono un ruolo chiave nella degradazione della chitina, e quindi dei miceli
fungini, non solo in suoli acidi, ma anche in quelli alcalini.
Studio e selezione di nuovi ceppi di funghi antagonisti appartenenti a diversi generi. E’ stato effettuato uno studio sulle capacità antagoniste di 41 ceppi appartenenti ai generi Trichoderma, Gliocladium, Sepedonium, Chaetomium nei confronti di 5 diverse specie di funghi scleroziali. I dati ottenuti hanno permesso di identificare due ceppi di Sepedonium chrysospermum particolarmente attivi contro Sclerotinia sclerotiorum e R. solani. Queste interazioni antagoniste sono state studiate in vitro determinando le condizioni fisico-chimiche migliori per il biocontrollo e per la sporulazione dell’antagonista. Ulteriori studi, non completamente pubblicati, hanno permesso di purificare il principio antibiotico (identificato come un’orcinaldeide) utilizzato da S. chrysospermum durante il biocontrollo, e una chitinasi e una glucanasi (co-prodotte con l’orcinaldeide) secrete in grandi quantità da questo antagonista durante il micoparassitismo, tra l’altro anche di funghi eduli.
Lotta
biologica al tumore radicale del pesco utilizzando ceppi di Agrobacterium
radiobacter K84. All’allestimento
e valutazione di una prova quinquennale di lotta biologica al tumore del pesco,
in cui sono stati saggiati il ceppo antagonista K84 e un isolato tumorigeno. Sono
stati analizzati 655 ceppi di agrobatteri isolati da piante ammalatesi. L’efficacia
del K84 è stata sempre molto elevata, e non si è osservato un effetto selettivo
in favore degli agrobatteri tumorigeni insensibili all’antagonista né uno sviluppo
di una popolazione resistente al K84. Questi risultati hanno indicato l’utilità
del K84 per il controllo del tumore radicale delle locali coltivazioni di pesco.
Prove di lotta biologica
in campo e in serra utilizzando diversi miceti antagonisti.
Allestimento e valutazione di esperimenti di lotta biologica in serra e in campo.
In particolare sono state saggiate diverse formulazioni di funghi antagonisti
(spray, granulare, per l’immersione dell’apparato radicale) nel tentativo di controllare
la Fusariosi del melone e del garofano, la Peronospora della patata, la Rhizoctonia solani su tabacco
e patata, l’Armillaria mellea
su pesco (i risultati di queste prove non sono stati pubblicati). Interazioni
con agricoltori e aziende agricole utili per la sperimentazione e l’applicazione
di questi nuovi biofungicidi, e con aziende italiane e straniere che stanno commercializzando
questi nuovi tipi di prodotti antiparassitari.
Studio ultramicroscopico dei tessuti germinali di Euphorbia peplus e di Capparis spinosa. Questa attività di ricerca, effettuata per lo più negli anni 1988 e 1989 a seguito dell’esperienza di lavoro sperimentale per la tesi di laurea, ha descritto la struttura microscopica del megagametofito di E. peplus indicando, tra l’altro, caratteristiche ultrastrutturali che distinguono questa specie da altre Euphorbiacee. E’ stato individuato un particolare componente citoplasmatico nell’endosperma di E. peplus, costitutito da un complesso sistema di sacculi formanti un reticolo endoplasmico sui generis, descritto per ora solo in questa specie. Altre pubblicazioni, derivate direttamente dal lavoro di tesi, hanno descritto l’ultrastruttura dell’antera e del tappeto, e aspetti citologici delle varie fasi dell’ontogenesi del polline di cappero (C. spinosa) (publicazioni).
Studio della biologia della riproduzione e dei gametangi dell’alga marina Halimeda tuna. E’ stata studiata la popolazione di H. tuna, l’unica alga del genere Halimeda presente nel mediterraneo, determinando la presenza di talli fertili in una popolazione della costa toscana. E’ stato scoperto, ad esempio, che la maturazione dei talli non dipende dallo sviluppo somatico, e che il rilascio di gameti dipende dall’esposizione a precise quantità di luce. In aggiunta, i gametangi fertili sono stati studiati al microscopio elettronico a scansione e trasmissione, descrivendo per la prima volta la loro ultrastruttura e quella dei gameti in via di maturazione (publicazioni).